Lo studio dei vari elementi muscolari è scrupolosamente affrontato più volte ed essi sono riprodotti assai fedelmente. Leonardo ha introdotto un originale metodo di studio degli elementi morfologici degli arti e dei loro muscoli: si tratta di un procedimento usato anche dai più moderni anatomisti.
Un
ulteriore innovazione introdotta da Leonardo nello studio della miologia è
quella della sostituzione figurativa dei muscoli degli arti con fili di rame
ricotto inseriti nei punti dello scheletro corrispondenti alle rispettive
inserzioni muscolari. Tale metodo permise a Leonardo la precisazione della
finalità funzionale di molti muscoli e l' individuazione del sinergismo e
dell' antagonismo dei muscoli. Leonardo a questo proposito fece delle indagini
sui punti in cui i vasi sanguigni e i nervi penetrano nella carne muscolare e il
vario modo di questi ultimi di fissarsi allo scheletro.Inoltre si occupò in generale dello studio dei muscoli della faccia, delle labbra, della bocca e dell' avambraccio e della loro distinzione tra volontari e involontari. In particolare nell'esaminare la muscolatura del viso è riuscito a stabilire un nesso tra i movimenti dei muscoli e l'espressioni: proprio questo gli ha permesso di compiere il miracolo della Gioconda.
La contrazione muscolare fu attentamente studiata da Leonardo sia con finalità artistiche che scientifiche. Tuttavia non gli riuscì di interpretare correttamente la natura di tale fenomeno e attribuì l'ingrossamento del muscolo contratto ad un forte accumulo in esso di sangue, secondo quando insegnavano le antiche dottrine.